HEPENGBIO純化線粒體氧化應激活性氧（ROS）高質熒光測定試劑盒產品說明書
 
主要用途
 
HEPENGBIO純化線粒體氧化應激活性氧（ROS）高質熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在線粒體氧化條件下，產生熒光，來定量檢測線粒體內活性氧族的生成和增加的方法。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩定。
 
技術背景
 
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM-H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級產品，一種完全自由通過細胞膜，并在細胞內長期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧化基、次氯酸等氧化，便產生熒光。據此測定線粒體活性氧族的濃度。
 
產品內容
 
HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）      3毫升
HEPENGBIO補充液（Reagent B）      3毫升
HEPENGBIO染色液（Reagent C）     40微升
產品說明書 1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里，HEPENGBIO染色液（Reagent C），嚴格避免光照；有效保證6月
 
用戶自備
 
黑色96孔板：用于樣品操作的容器
培養箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于觀察熒光線粒體
熒光酶標儀：用于測定線粒體熒光強度
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑放進冰槽里融化，避免光照；同時從－80℃冰箱里取出待測的線粒體，放進冰槽里融化。然后進行下列操作。
1． 準備1個黑色96孔板，標記好背景對照孔和待測樣品孔
2． 分別加入150微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent A）
3． 移取50微升線粒體懸液（總量為50微克線粒體蛋白）到黑色96孔板的相應待測樣品孔里
4． 加入50微升HEPENGBIO補充液（Reagent B）到黑色96孔板的相應背景對照孔里
5． 分別加入2微升HEPENGBIO染色液（Reagent C）到上述孔里
6． 放進37℃培養箱里孵育15分鐘，避免光照
7． 選擇下列方式之一進行操作：
a) 使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：
1）移取10微升上述懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發波長490nm，散發波長530nm――
綠色熒光增強，表明活性氧族（ROS）含量高
 
b) 或使用熒光酶標儀檢測（定量檢測）：
1）直接放進熒光酶標儀：激發波長490nm，散發波長530nm――
樣品RFU－對照RFU＝實際線粒體RFU：增高，表明活性氧族（ROS）含量高
 
注意事項
 
1． 本產品為20次操作
2． 操作時，須戴手套
3． 孵育時，須避免光照
4． 建議染色完成后，即刻進行熒光分析
5． 本公司提供膜電位或呼吸鏈依賴性活性氧檢測試劑產品
6． 本公司提供系列活性氧檢測試劑產品
 
質量標準
 
1． 本產品經鑒定性能穩定
本產品經鑒定熒光清晰